臨床遺伝学講座では、遺伝性難病、特にリソソーム病(ライソゾーム病)の研究を行っています。
本講座における研究活動の概要をご紹介します。



研究項目

1.ファブリー病の分子病態解明とデータベース構築
2.ファブリー病のハイリスク・スクリーニングと診断システムの確立
3.ファブリー病のバイオマーカーの探索
4.ファブリー病に対する新しい治療薬の開発
5.その他のリソソーム病の研究




1.ファブリー病の分子病態解明とデータベース構築

ファブリー病は、α-ガラクトシダーゼA(GLA)の活性低下によって起こる遺伝病です。ヒトの体を構成する細胞内には、リソソーム(別名 ライソゾーム)と呼ばれる膜で囲まれた小器官があり、内部環境のpHが酸性に維持されています。そして、リソソーム内には酸性条件下で働く沢山の加水分解酵素が存在して、細胞内で不用になった物質の分解を担っています。GLAは、このようなリソソーム酵素のひとつであり、グロボトリアオシルセラミド(Gb3)などの糖脂質を分解する役割をはたします。ファブリー病の場合、GLAの働きが低下するため、Gb3などの糖脂質が分解されずに体内に蓄積して、様々な臓器の障害を来たします。
GLAをコードするGLA遺伝子はX染色体に存在するため、ファブリー病は、X染色体連鎖の遺伝型式をとります。典型的な臨床経過をとる「古典型ファブリー病」の男性患者さんでは、少年期から青年期にかけて、手足の痛み、低汗症、被角血管腫や角膜混濁などの症状がみられ、成人期になると腎障害、脳血管障害や心障害が進行します。消化器障害、聴覚障害や呼吸障害が出現することもあります。また、少年期や青年期には症状がみられず、成人期になってはじめて腎障害や心障害が出現する「遅発型ファブリー病」の男性患者さんもいます。一方、ファブリー病の女性は、ひとつの体細胞内に2本あるX染色体のうちの片方に病気の遺伝子があるため「ファブリー病ヘテロ接合体」と呼ばれます。こうした女性では、X染色体のランダムな不活化の影響を受けて、無症状の方から重症の方まで多様な臨床像を示します。
私たちは、こうしたファブリー病の病態を明らかにするため、GLA遺伝子やGLA蛋白質の解析を行っています。これまでに多くのファブリー病の原因遺伝子変異や機能的多型(E66Qなど) を同定すると共に、こうした遺伝子の変化がGLA蛋白質の構造に影響を与え(図1), さらには、それがGLA活性低下を来たして(図2)、多様な臨床像に結びつく機序について研究しました。そして、その情報をファブリー病データベース(http://fabry-database.org/)にまとめて公開しています。


図1. GLAの構造変化と臨床表現型
それぞれ、M72R(左上)、M72I(右上)およびM72V(左下)の遺伝子変異によって起こるGLAの構造変化をin silico で推測したものです。GLAの全体構造を灰色のスティックモデルで、アミノ酸置換により影響を受ける原子を球モデルで示しています。変化の大きさが球の色で表されます。GLA蛋白質を構成するアミノ酸の位置が同じ(ここでは、72番目のアミノ酸で、野生型ではメチオニンに相当)でも、M72RやM72Iのような遺伝子変異によるアミノ酸置換では大きな構造変化を来たして、臨床表現型が古典型ファブリー病となります。一方、M72VではGLA の構造変化が小さく、遅発型ファブリー病になることがわかります。




図2. 血漿中のGLA活性測定結果
古典的ファブリー病男性では、GLA活性が著明に低下するのに対し、遅発型ファブリー病男性の多くは僅かながら残存活性が認められます。一方、ファブリー病ヘテロ接合体の女性のGLA活性は、極めて低いものから、対照と区別出来ない程高いものまで多様です。





2. ファブリー病のハイリスク・スクリーニングと診断システムの確立
最近の研究結果から、ファブリー病は希少疾患ではあるものの、その発生頻度は、従来予想されていたよりも高いことがわかってきました(イタリアでは1/3,000 - 4,000, 台湾では1/1,250, 日本では1/8,000 - 9,000という報告がされています)。おそらくは、原因不明の腎、心および脳血管障害を伴う患者群の中に、ファブリー病の患者さんが隠れていると推測されます。また、ファブリー病に対しては、組換えヒトGLAを定期的に点滴で静脈内投与する酵素補充療法が有効ですが、病気が進んでしまうと、治療効果が著しく低くなることがわかってきました。そこで、ファブリー病患者さんを早期に診断することの重要性が明らかになりました。
本講座では、ファブリー病の早期診断を目的として、手足の痛み、低汗症、被角血管腫、角膜混濁や腎、心および脳血管障害などの症状を持つ男性患者さんを対象として、ファブリー病のハイリスク・スクリーニングを行っています。このスクリーニングシステムでは、まず微量の血清を試料としてGLA酵素活性を測定します(一次検査)。次に、一次検査で血清GLA酵素活性がカットオフ値より低い方を対象として、白血球を試料に、そのGLA活性を精密測定して、活性低下の程度からファブリー病か否かを判定します。また、必要時には、GLA遺伝子解析、血漿中グロボトリアオシルスフィンゴシン(Lyso-Gb3)測定や尿Gb3測定を行い、その解析結果を基に診断を確定します(これらの検査結果は、家系診断や患者さん本人の病状把握および治療が行われた場合の効果判定などに役立ちます)(図3)。一方、ファブリー病女性患者さんの場合、X染色体のランダムな不活化により、臨床試料中のGLA活性が著しく低いものから非患者さんの活性値と区別出来ないものまで多様な値を示すため、単純にGLA活性測定だけで判断することは困難です。そこで、同じ家系にファブリー病患者さんがおられたり、生検組織の病理検査結果からファブリー病が疑われる場合などに、遺伝子解析、血漿中Lyso-Gb3測定、尿中Gb3測定や白血球中GLA活性測定などを行い、総合的観点からファブリー病の診断を行っています(図4)。
ファブリー病診断のための解析を依頼される方は、下記のファイルをご参照ください。


図3. 男性を対象としたファブリー病診断のための解析の手順



図4. 女性を対象としたファブリー病診断のための解析の手順






【リンク用 ファイル】

ファブリー病のハイリスク・スクリーニングと診断のための解析を依頼される皆様へ

診断用ファイルのダウンロード:ZIP形式





3.ファブリー病のバイオマーカーの探索
ファブリー病の診断や治療効果の判定には、バイオマーカーが役立ちます。ファブリー病のバイオマーカーとして、これまで、体内への主要な蓄積物質であるGb3の血漿中濃度の測定値が用いられてきました。しかし、Gb3は、非患者さんの血漿中にもかなりの量が存在し、遅発型ファブリー病の男性患者さんや多くのファブリー病ヘテロ接合体女性患者さんの血漿中Gb3の値は、非患者さんのそれと区別がつきません。
そこで、Gb3よりも優れたファブリー病バイオマーカーがないか、探索しました。そして、Gb3を構成する脂肪酸の部分が脱落したグロボトリアオシルスフィンゴシン(Lyso-Gb3)に注目しました(図5)。Lyso-Gb3は、生体内では、ごく微量しか存在せず、僅かでも体内に蓄積すると、平滑筋の増殖、血管壁の肥厚、TGF-β1の発現促進、腎臓のタコ足細胞の障害や細胞外マトリックスの増加を起こすと考えられています。
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法で血漿中のLyso-Gb3を測定すると、ごく一部の遅発型ファブリー病男性(M296Iなどの遺伝子変異を持つ方を指します)やファブリー病ヘテロ接合体女性症例を除く殆どのファブリー病患者さんで、健常者や機能的多型(E66Q)を持つ方に比べて高い値が得られました(図6)。また、組換えGLAを用いた酵素補充治療を行うと、これらの値が低下することも明らかになりました。
私たちは、HPLCを用いる方法よりも、微量の試料を用いて高感度に血漿Lyso-Gb3を測定出来る液体クロマトグラフィー/タンデム型質量分析(LC-MS/MS)法を導入し、HPLC法では、対照と区別出来なかったファブリー病患者さんの診断にも役立つよう、研究を進めています。


図5. Gb3とLyso-Gb3の構造



図6. 血漿中Lyso-Gb3濃度の測定結果




4.ファブリー病に対する新しい治療薬の開発
ファブリー病に対する治療として、現在、組換えGLAを2週間に1回の頻度で静脈内に点滴投与する酵素補充療法が行われています。組換えGLAは、ヒトのGLA遺伝子に基づく酵素をヒト由来培養線維芽細胞やチャイニーズハムスター卵巣由来の細胞(CHO細胞)で発現し、生産したものが使用されます。酵素補充療法の導入により、臓器障害が進行する前に治療を開始すれば、病気の進行阻止に大きな効果があることが報告されています。
しかし、ファブリー病の男性患者さんの多くは、体内にGLAを持っていません。そのため、こうした方たちの場合、組換えGLAを繰り返し投与すると、組換えGLAに対する抗体が産生されてアレルギー性有害副反応がみられたり、治療効果が減弱することがあることも明らかになりました。
私たちは、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ(NAGA)という酵素に注目しました。この酵素は、α-ガラクトシダーゼBとも呼ばれ、Gb3やLyso-Gb3を分解する機能は持っていませんが、その立体構造は、GLAによく似ていて、GLAよりも安定です。そこで、私たちはGLA分子を構成するアミノ酸のうち、基質認識に係る203番目のグルタミン酸と206番目のロイシンに相当するNAGAのアミノ酸を調べた所、それらは、188番目のセリンと19番目のアラニンであることがわかりました。私たちは、NAGAの188番目のセリンをグルタミン酸に、191番目のアラニンをロイシンに置換した改変型NAGAを分子設計し(図7)、それをCHO細胞で大量生産する系を作りました。出来上がった改変型NAGAは、Gb3やLyso-Gb3を分解する機能を獲得し、GLAに比べて大変安定でした。また、GLAとは免疫原性も異なることが示されました。この改変型NAGAをファブリー病モデルマウスに投与すると、肝臓、心臓や腎臓に蓄積していたGb3などの糖脂質が減少することがわかりました。ファブリー病の患者さんは、もともと体内にNAGAを持っていることから、改変型NAGAを投与してもそれに対する抗体を作りにくく、また、安定性が高いことから体内で活性が持続することも期待されます。今後、さらに改善を加えて、ファブリー病の新規治療薬開発に向けて努力したいと考えています。
私たちは、酵素補充療法以外にも、低分子化合物によるファブリー病治療のための基礎研究も行っています。現在、基質アナログを変異酵素に結合させ、そのリソソームへの輸送過程における安定化を目指すシャペロン療法(図8)の治療薬の開発がいろいろな施設で行われています。私たちは、シャペロン療法治療薬候補となる低分子化合物の酵素への結合と解離について、表面プラズモン共鳴(SPR)や等温滴定カロリメトリー(ITC)などの物理化学的解析法により、調べています。また、両者の結合様式についても、様々な構造学的方法を利用して調べています。これらの解析結果から、より優れたファブリー病治療の開発を目指したいと思います。


図7. GLA, NAGAおよび改変型NAGAの立体構造
図の上部は全体構造(酵素をリボンモデルで、基質をスティックモデルで示している)を、図の下部はそれぞれの酵素の活性部位(基質が結合した状態)を示す。


図8. シャペロン療法の原理





5.その他のリソソーム病の研究
私たちは、ファブリー病の他に、テイ-サックス病、ザンドホッフ病、GM1ガングリオシドーシス、ゴーシェ病、ポンぺ病、シアリドーシス、ガラクトシアリドーシスやムコ多糖症などのリソソーム病を対象として、分子遺伝学、生化学や構造生物学的視点から研究を行っています。
ムコ多糖症T型(http://mps1-database.org/)ムコ多糖症Y型(http://mps6-database.org/)のデータベースには、これらの疾患の研究結果をまとめています。